供體細(xì)胞——克隆成功的關(guān)鍵

體細(xì)胞核移植技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，尤其是基因修飾大動物。供體細(xì)胞提供克隆胚胎的主要遺傳物質(zhì)，是體細(xì)胞克隆成功與否的關(guān)鍵因素之一。供體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、周期、活性以及供體的個體差異、性別年齡等都會對克隆效率有影響。正常機(jī)體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動態(tài)平衡狀態(tài)。外界環(huán)境刺激和機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)代謝過程中產(chǎn)生大量活性氧（Reactiveoxygenspe-cies，ROS），對酶及轉(zhuǎn)錄因子的活化、mRNA表達(dá)等有較大的影響。有研究結(jié)果顯示SOD及CAT基因的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)改變，這可能與細(xì)胞抵抗外來刺激有關(guān)，但細(xì)胞的抗氧化能力是否發(fā)生改變，更準(zhǔn)確的應(yīng)該在翻譯水平上對SOD及CAT基因的活性進(jìn)行檢測。ROS對細(xì)胞膜或者DNA產(chǎn)生傷害，促使凋亡相關(guān)基因表達(dá)的改變而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白家族與p53基因是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，兩者相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2和Bax基因形成異源二聚體比例增加時，抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，G418處理后細(xì)胞Bcl-2/Bax基因的比例有所提高，促凋亡基因p53的表達(dá)量下調(diào)，這可能是細(xì)胞自身應(yīng)對G418所帶來的外來刺激而產(chǎn)生的一種自我保護(hù)，通過調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。

在體細(xì)胞核移植中，DNA甲基化是調(diào)控供體核內(nèi)重編程的一種方式，對恢復(fù)細(xì)胞的性、提高體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的效率具有重要意義。哺乳動物基因組中，轉(zhuǎn)座元件占到了50%左右，LINE是轉(zhuǎn)座元件中所占比例大的一種類型。LINE-1是LINE中的主要類型，在染色體中散在分布，約占小鼠和人類基因組的17%～20%。微衛(wèi)星是真核生物基因組重復(fù)序列中的主要組成部分，隨機(jī)、廣泛地分布于基因組中，大約占到豬全基因組的0.85%。因此LINE-1和微衛(wèi)星的甲基化水平基本可代表整個基因組的甲基化水平。Dnmt1和Dnmt3a分別是維持DNA甲基化和從頭甲基化的關(guān)鍵酶。研究表明，敲除小鼠的Dnmt1基因，會導(dǎo)致嚴(yán)重的基因組去甲基化或胚胎死亡;敲除Dnmt3a基因，小鼠在出生后4周內(nèi)死亡。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)G418處理后，核供體細(xì)胞的Dnmt1和Dnmt3a基因的mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明G418會影響細(xì)胞內(nèi)重要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達(dá)，但不影響細(xì)胞整體甲基化水平G418處理核供體細(xì)胞對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響。71本研究經(jīng)高質(zhì)量濃度G418處理后的供體細(xì)胞進(jìn)行核移植所獲得的重構(gòu)胚的融合率、卵裂率和囊胚率均顯著低于對照組，而囊胚細(xì)胞總數(shù)沒有顯著差異。這說明供體基因組的整體甲基化水平與克隆胚胎的發(fā)育能力可能沒有必然。這可能是核移植之后G418的毒性作用仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，從而影響了細(xì)胞生長及克隆胚胎的發(fā)育性能。顧曉龍等利用RG108處理供體細(xì)胞并進(jìn)行甲基化水平的檢測，發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞整體甲基化水平的改變可能對提高核移植效率沒有直接影響。Bonk等使用低密度甲基化芯片技術(shù)檢測克隆供體細(xì)胞、精子、克隆囊胚、體內(nèi)囊胚等的甲基化水平，同樣發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞整體甲基化水平的差異并非體外生產(chǎn)的囊胚發(fā)育率低下的主要原因，而某些區(qū)域特定的DNA甲基化修飾才是促進(jìn)重構(gòu)胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。